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更新時間：2024-12-03 | 點(diǎn)擊率：110

技術(shù)介紹

CRISPR/Cas9 是一種基于細(xì)菌天然免疫機(jī)制開發(fā)出來的基因編輯技術(shù)，用于抵御病毒等外來物入侵的一種防御機(jī)制。經(jīng)改造的CRISPR系統(tǒng)主要由Cas9蛋白和單鏈向?qū)NA（sgRNA）組成，其中sgRNA對靶序列進(jìn)行特異性識別，Cas9蛋白負(fù)責(zé)對識別的靶序列進(jìn)行切割，從而實(shí)現(xiàn)DNA的雙鏈斷裂。

DNA雙鏈斷裂后，細(xì)胞對DNA的損傷修復(fù)機(jī)制就會被激活。目前主要有兩種修復(fù)機(jī)制，非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)和同源重組介導(dǎo)的修復(fù)（HDR）。沒有外源模板時，機(jī)體主要進(jìn)行NHEJ修復(fù)。NHEJ修復(fù)過程中，會在切割位點(diǎn)隨機(jī)的進(jìn)行缺失或插入堿基序列，導(dǎo)致DNA移碼突變，從而使基因不能正常表達(dá)。存在外源模板的情況下，機(jī)體會啟動HDR修復(fù)來實(shí)現(xiàn)基因的精準(zhǔn)插入或者替換。

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KO 細(xì)胞系的應(yīng)用

目前，利用CRISPR-Cas9構(gòu)建基因敲除（KO）細(xì)胞系的技術(shù)已經(jīng)越來越成熟，那么KO細(xì)胞系的應(yīng)用有哪些？可以幫助我們解決什么問題呢？

基因功能研究

由于模式生物基因組測序系統(tǒng)的逐漸完善，使CRISPR/Cas9技術(shù)在基因組中同時進(jìn)行多靶位點(diǎn)的編輯成為可能。研究表明將缺失突變引入不同基因的編碼外顯子中，可以在人細(xì)胞中當(dāng)做強(qiáng)大的陰性和陽性篩選對照。與先前的 RNAi 技術(shù)的脫靶嚴(yán)重、編輯效率低及僅限于轉(zhuǎn)錄過程相比，CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的篩選可更好的實(shí)現(xiàn)專一性和敏感性，設(shè)計(jì)的sgRNA可以靶向任何 DNA 序列。RNAi 方法只導(dǎo)致基因表達(dá)抑制，而CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生的Indels可以致使基因功能喪失，比RNAi 出現(xiàn)更加明顯的表型，這更容易鑒定目的基因。

藥物靶點(diǎn)的確定

利用CRISPR-Cas9技術(shù)建立基因缺失病變的KO細(xì)胞模型，有助于研究疾病的發(fā)病機(jī)制和篩選潛在的藥物靶點(diǎn)，并通過高通量藥物反應(yīng)數(shù)據(jù)，初步篩選出在特定藥物處理下細(xì)胞存活率變化顯著的細(xì)胞系，進(jìn)而評估藥物對特定基因敲除細(xì)胞的影響，從而篩選出有效的藥物候選物。從基因的功能研究到藥物靶點(diǎn)的篩選，再到藥物效果的評估及驗(yàn)證，KO細(xì)胞系提供了一個強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)平臺，加速了新藥的研發(fā)進(jìn)程。

同時，KO細(xì)胞系不僅在細(xì)胞層面上有所應(yīng)用，還可以用于構(gòu)建動物模型，進(jìn)一步研究藥物在體內(nèi)的作用機(jī)制和治療效果，尤其是在遺傳性疾病的治療研究中發(fā)揮著巨大作用。

抗體的特異性鑒定

抗體是生命科學(xué)研究中的常用試劑之一，抗體的特異性對研究者們至關(guān)重要。抗體的特異性是指抗體能夠識別并結(jié)合到其目標(biāo)抗原的能力，而不與其他非目標(biāo)分子發(fā)生交叉反應(yīng)。特異性抗體可以減少實(shí)驗(yàn)中的誤差，降低了非目標(biāo)分子的干擾，有助于提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。

目前，基因敲除驗(yàn)證（KO）是廣受信任且接受度最為廣泛的抗體特異性驗(yàn)證方法之一。利用CRISPR-Cas9技術(shù)，構(gòu)建目的基因缺失的KO細(xì)胞系。如果抗體是特異性的，那么不應(yīng)該檢測到信號，而在野生型（WT）細(xì)胞系中則應(yīng)該檢測到特異性靶蛋白的信號。KO細(xì)胞系提供了真正意義上的陰性對照，一度被稱為“抗體特異性驗(yàn)證的金標(biāo)準(zhǔn)"，以確認(rèn)抗體對目標(biāo)蛋白的特異性。

PART.1

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